서 론
포도는 영양 번식 작물로 생육기간 동안 매개 충, 전정 작업 등 접촉에 의해 바이러스에 감염되기 쉽다. 바이러스에 감염된 나무는 생육부진, 과실수량 감소, 착색불량, 당도 저하 등을 나타내며 이로 인한 경제적 손실을 입게 되지만 아직까지 바이러스에 대한 뚜렷한 화학적 방제가 없기 때문에 바이러스가 없는 묘목을 재배하는 것이 최선의 방법으로 알려져 있다(Krul와 Worley, 1997; Li와 Eaton, 1984; Sadamatsu, 1987; Yu와 Meredith 1986). 이에 대하여 유묘생산을 위한 배지조성(Choi 등, 1988; Choi 등, 1992), 대량번식을 위한 미숙배주의 체세포 발생(Park 등, 1993) 그리고 열 처리법, 경정배양법, 캘러스 배양을 통한 바이러스 무병묘 생산 등에 대한 연구들이 보고되었다(Engelbrecht와 Human, 1989). 포도 조직배양은 유묘의 증식에 적합한 배지조성(Choi 등, 1988; Choi 등, 1992), 대량번식을 위하여 미숙배주 배양을 통한 체세포배 발생에 대한 연구(Park 등, 1993) 등이 보고되었고 바이러스 무병 묘 획득은 열처리법과 경정배양법, 경정배양과 캘러스 배양으로 가능하다는 연구가 있다(Engelbrecht와 Human, 1989). Kim 등(2003)은 화학약품 처리보다는 열처리 후 생장점을 배양하는 방법이 가장 효과적이라고 하였다. 기내 묘는 밀폐된 환경에서 인위적으로 당을 공급받기 때문에 광합성 작용이 매우 제한적이며 항온상태와 높은 습도 때문에 수분과 무기이온의 흡수율, 탄소원의 이용률이 낮다(Kozai와 Kitaya, 1993), 이러한 기내환경으로 증식효율이 떨어지고 비정상적인 묘의 발생이 많아지며, 가스의 교환이 제한되어 식물체의 표피층과 기공의 발달이 불량해져 심한 환경스트레스로 생장이 지연되거나 말라 죽게 되어 묘의 생산효율성이 매우 낮다고 보고되었다(Grout와 Aston, 1977; Kozai와 Kitaya, 1993). 스타치스(Kozai 등, 1987), 카네이션(Kozai와 Iwanami 1988), 거베라(Lee 등, 2001a; Lee 등, 2001b) 등의 화훼류 배양 묘 생산에 있어 광도와 CO2농도를 조절하여 배양 묘 생육에 유리한 환경개선을 시도한 바가 있다. 포도 배양 묘 생산에 있어서도 sucrose, 생장조절제, 수분 potential이 낮은 한천, 밀폐용기 등을 사용하고 있기 때문에 불량한 기내환경으로 인하여 투명화 묘의 발생빈도가 높다. 또한 묘의 도장, 큐티클 층의 발달저조 등을 야기 시켜 기외 이식 후에 묘의 활착과 생육을 저해시키고 있다. 포도 ‘My heart’는 일본 시무라 포도연구소에서 ‘Shine Muscat’과 ‘Wink’를 교배하여 육성한 품종으로 포도 알이 붉은 색의 하트모양으로 특이하고 씨 없이 껍질 채 먹는 품종이다. 바이러스 감염은 과실의 당도저하, 착색불량 등 상품성을 저하시키는 주요 요인으로 작용하고 있어 바이러스 무병 묘의 생산 및 이용에 대한 관심이 높다. 이에 본 실험에서는 배양용기에 부착한 미세공극 Filter 처리가 포도 ‘My heart’의 기내증식과 기외이식 후 생장에 미치는 결과를 조사하여 건전한 유묘를 생산하는데 효과적인 방법을 찾고자 실시하였다.
재료 및 방법
1. 기내배양
식물재료는 포도(Vitis vinifera) ‘My heart’(Shimura Grape Research Institute, Japan)를 사용하였고 초기 배양을 위한 shoot tip은 0.3－0.5mm 크기로 절취하여 각 처리별로 100개씩 치상하였다. 기본배지는 MS(Murashige와 Skoog, 1962) 무기염에 Glycine 2.0mg·L-1, Myo-Inositol 100.0mg·L-1, Nicotinic acid 0.5mg·L-1, Pyridocxin HCl 0.5mg·L-1, Thiamine HCl 0.1mg·L-1가 포함된 MS Powder(M0222, Duchefa Biochemie, Netherlands, 이하 MS)를 사용하였다. 초기 배양과 shoot 증식 배양은 6-Benzylaminopurine(B0904, Duchefa Biochemie, Netherlands, 이하 BAP) 1.0mg·L-1, Indole-3-Butyric acid(I0902, Duchefa Biochemie, Netherlands, 이하 IBA) 0.1mg·L-1, 발근배양은 IBA 2.0mg·L-1를 1N-NaOH로 완전히 녹여서 배지에 첨가하였다. 배지는 MS powder 4.4g, Sucrose 30.0g, Agar 8.0g을 첨가한 후에 Distilled water로 1,000mL로 정량한 다음 pH 5.8로 조절하였다. Agar를 투명하게 녹이고 처리별 배양용기에 100mL 씩 분주하였다. Shoot tip은 배양용기마다 5개씩 20반복으로 치상하였고, 기내 shoot는 배양용기에 4개씩 10반복으로 배양하였다. 배양환경은 온도 25±2℃, 광도 40μmol·m-2·s-1, 일장 16시간으로 하여 30일 간격으로 계대 배양하였다.
2. 미세공극 Filter 처리
외부 공기와 배양용기 내부와의 공기 순환을 위하여 배양용기 뚜껑에 부착한 Filter에 따라 배양용기를 2가지 type으로 처리하였다. 배양용기(E1650, E1654, Duchefa Biochemie, Netherlands)는 polypropylene 재질의 라운드 모양으로 크기가 바닥 125.0×65.0mm, 뚜껑 150.0×90.0mm, 용기 높이는 80mm이다. Filter 처리는 배양용기 뚜껑에 길이 50mm, 폭 16mm의 라운드 모양의 구멍을 뚫고 녹색(이하 Green filter)과 백색(이하 White filter)으로 구분하였다. Filter는 Fig. 1과 같이 길이 50.0mm로 동일하게 하고 폭은 녹색 7.0mm, 백색 3.5mm로 달리하였다. 밀폐처리(이하 Airtightness)는 필터부위를 투명 접착테이프를 이용하여 배양용기 내부와 외부가 차단되도록 하여 Green filter와 White filter를 비교하였다. Shoot tips 배양은 MS powder 4.4g·L-1, sucrose 30.0g·L-1, BAP 1.0mg·L-1, IBA 0.1mg·L-1를 첨가한 배지에 Filter 처리하여 30일 간격으로 새로운 배지로 계대배양하였다. 계대배양에서 발생한 투명화 묘는 Shoot tips 배양과 동일한 배지에 Green filter 처리하여 30일 간격으로 90일 동안 계대배양하면서 투명화 묘의 발생율과 증식한 shoot 수를 조사하였다. 증식한 기내 묘는 MS powder 4.4g·L-1, sucrose 30.0g·L-1, IBA 2.0mg·L-1를 첨가한 배지에서 30일간 배양한 후에 발근율, 뿌리 수, 초장, 엽수 등을 조사하였다.
Filter 처리에 따른 기내 묘의 기공은 잎 뒷면을 광학현미경(Nikon, JP/ECLIPSE Ni-E)을 사용하여 200배의 배율로 관찰하였다.
3. 기외이식 후 생육
Filter 처리에 따라 배양한 기내 묘는 원예용 상토(Baroker, Corporation SEOUL BIO, Korea)를 직경 9cm 흑색비닐 pot에 채운 후 기내 묘를 이식하였다. 기외 환경은 온도와 습도제어가 가능한 순화용 유리온실에서 온도 25±5℃, 상대습도 40－60%, 광도는 맑은 날 정오가 200－300μmol·m-2·s-1로 유지되도록 차광하였다. 기외이식 15일 후에 유묘의 생존율, 뿌리길이, 엽수, shoot 경경, 생체중 등을 조사하였다. 집단 간 평균 차이 검증은 통계프로그램 SAS version 9.4(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하였으며 평균과 표준오차를 구하여 p ≤ 0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test를 실시하였다.
결과 및 고찰
1. Filter 처리에 따른 배양 묘 생육
포도 ‘My heart’를 초기 배양하였을 때 shoot 분화(Fig. 2A)는 밀폐 처리에서 분화율 80%로 가장 높았고, White filter는 77%, Green filter 75%였다. 분화한 shoot 중에서 투명화 shoot의 발생률(Fig. 2B)은 밀폐 용기가 24.7%, White filter는 13.4%, Green filter는 4.0%로 낮았다. 투명화는 발생 원인으로 엽록소 결핍, 배양용기 내부의 수분과다(Kevers 등, 1984), 조직 내 Ligrin 합성의 저해(Phan과 Hegedus, 1986), 고농도의 생장조절제 첨가, 배양환경(Bottcher 등, 1988) 등에 의해 발생빈도가 결정된다고 하였다. 투명화 묘는 작물에 따라 발생빈도가 차이 있으나 카네이션, 안개초 등 화훼류의 종묘생산 효율을 좌우하는 원인이 된다고 보고된 바가 있다(Paek과 Han, 1988). 포도 ‘My heart’ 초기 배양에서는 밀폐 처리가 shoot 분화율이 다른 처리에 비해 다소 높았지만 filter 처리와는 달리 외부 공기가 유입되지 않는 배양 용기내부의 과도한 습도에 의해 투명화 shoot가 많이 발생하였다.
밀폐 용기에서 연속적인 배양으로 발생한 투명화 shoot를 Green filter 처리하여 30일 간격으로 90일 동안 3차 계대배양하면서 투명화 묘의 발생과 shoot 증식정도를 조사하였다. Green filter 처리하기 전 투명화 shoot 발생률은 54.9%였고 Green filter 처리 후 1차 계대배양 후 30일(filter 처리 30일) 경과했을 때 38.3%로 감소하였고, 2차 계대배양 30일 후(filter 처리 60일)에는 24.7%, 3차 계대배양 30일 후(filter 처리 90일)에는 11.8%로 점차 감소하였는데 Green filter 처리 일수가 경과함에 따라 투명화 shoot가 정상 묘로 회복됨을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). Shoot 발생 수는 배양일수가 길어질수록 점차 증가하였고 배양일수가 90일 때는 급격하게 증가하였다(Fig. 3B). 투명화가 심한 식물체의 잎은 두껍고 주름이 있거나 뒤틀려 있고 쉽게 부서지기 쉬운 조직으로 되어 있는 것이 특징이고 투명화 묘는 새로운 배지로 옮겨 배양하여도 shoot 증식이 되지 않고 배양기간이 길어지면 갈변하여 죽게 된다(Paek 등, 1997). 포도 ‘My heart’에 있어서도 밀폐 환경에서 배양기간이 길어질 수록 잎이 뒤틀리고 두꺼워졌으며 새로운 shoot가 발생하지 않고 갈변현상이 나타났다(자료 미제시). 포도 ‘My heart’의 투명화 묘는 Green filter 처리로 인하여 배양용기 내부의 배양 환경이 개선되어 투명화 묘의 발생을 감소시키고 shoot 발생 수를 증가시킬 수 있었다(Fig. 3).
IBA 2.0mg·L-1를 첨가한 발근배지에서 30일 동안 배양을 하였을 때 발근율은(Fig. 4A) 밀폐 처리와 filter 처리와는 차이가 있었으며 filter 처리들에서 유의하게 높았는데 Green filter에서는 100%를 나타내었다. 발생한 뿌리 수는(Fig. 4B) Green filter에서 7.3개로 가장 좋았고 White filter에서는 6.5개, 밀폐 처리에서는 뿌리 수 5.0개로 filter 처리들 보다 적었다. 유묘의 초장은 처리 간 차이가 없었으며 밀폐 처리에서 6.0cm로 가장 작았고 White filter 처리에서 6.8cm, Green filter 처리에서 6.5cm이었다(Fig. 4C). 엽수는 Green filter에서 10.0개로 가장 많았고 White filter 처리에서 8.8개, 밀폐 처리에서 7.5개로 가장 적었는데(Fig. 4D) Lee 등(1999)이 배양용기 뚜껑에 pore size 0.2µmol인 membrane filter를 부착하여 거베라 배양용기 내로 CO2를 공급하였을 때 무처리에 비하여 엽수, 엽 면적, 엽 내 SPAD value가 다소 좋았다고 보고한 연구결과와 일치하였다. 기내 묘의 광합성에 의한 생장과 발육은 광, CO2, 습도, 환기속도 등을 포함한 물리적 환경요인에 크게 영향을 받는데 Kozai 등(1992)은 감자배양에서 CO2 농도와 광도를 높여 줄 때 배양 묘가 탄수화물을 스스로 공급하는데 물리적 환경이 큰 요인으로 작용한다고 하였다.
Fig. 4
Rate of rooting (A), number of roots (B), plant height (C) and number of leaves (D) according to the culturing in different container types after 30 days. The seedlings were cultured at 4.4 g·L-1 of MS powder, 30.0 g·L-1 of sucrose, 2.0 mg·L-1 of IBA. Vertical bars represent standard errors of the mean values.
Filter 처리에 따라 30일 동안 배양한 유묘의 엽내 기공형태를 광학현미경을 이용하여 200배의 배율로 관찰하여 밀폐 처리와 비교하였다(Fig. 5). 밀폐와 White filter 처리에서 배양한 유묘는 기공이 모두 열린 상태를 보인 반면에 Green filter 처리는 열린 상태의 기공과 닫힌 상태의 기공이 혼재하고 있었다. 기내환경에 따라 거베라 배양 묘 잎의 구조적 특성이 보고된 바(Lee 등, 2001b)에 의하면 밀폐조건에서 배양한 유묘의 경우 표피층에 왁스의 결정형이 관찰되지 않았고 대부분의 기공이 열려 있었던 것과 일치하였다.
2. 기외이식 후 유묘생육
Filter 처리에 따라 발근한 shoot를 기외이식하고 15일 후에 유묘의 생존율, 초장, 줄기직경, 생체 중을 밀폐 처리와 비교하였다(Table 1). 생존율은 Green filter처리에서 100%로 가장 높았고 White filter 처리에서 98.5%, 밀폐 처리에서 70.5%였다. 유묘의 초장, shoot 직경, 생체중 등 전반적인 생장이 밀폐와 White filter 처리보다는 Green filter에서 높았다.
Table 1.
Survival rate, plant height, diameter of stem and fresh weight of seedlings according to the culturing in different container types when transplanted into plastic pots after 15 days in ‘My heart’.
| Container types | Survival rate (%) | Plant height (cm) | Stem diameter (mm) | Plant fresh weight (g) |
|
Airtightness White filter Green filter |
70.5 98.5 100.0 |
7.6 b 8.3 b 11.0 az |
1.2 a 1.3 a 1.6 a |
0.9 b 1.0 b 1.7 a |
이상의 결과를 종합해 볼 때 환기구를 가장 크게 처리된 Green filter에서는 shoot tip을 초기 배양할 때 White filter와 밀폐 처리보다 shoot 분화율은 2－5% 낮았지만 투명화 발생율은 9.4－20.7%가 감소되었다. 투명화 shoot를 Green filter 처리하여 90일 동안 배양하였을 때 투명화율이 54.9%에서 11.8%로 4.7배 정도 감소하였고 분화한 shoot 수는 89개에서 915개로 10.3배가 증가하였다. 기내 발근율, 뿌리 수, 엽수 등도 Green filter에서 가장 양호하였다. 기외 이식하고 15일 후의 shoot 생존율에 있어서도 Green filter에서 다른 처리에 비하여 1.5－29.5% 더 높았고 기외이식 후 계속되는 유묘 생장도 Fig. 6과 같이 Green filter 처리가 양호하였다.
